SEC-MALS

Annahmen der analytischen SEC

Die Größenausschlusschromatographie trennt Moleküle nach ihrer Größe (hydrodynamischer Radius). Die konventionelle analytische SEC setzt jedoch die molare Masse mit der Retentionszeit in Beziehung, indem sie annimmt, dass der Analyt in Übereinstimmung mit einer Säulenkalibrierkurve eluiert.

Damit die Säulenkalibrierung korrekt funktioniert, müssen diese Annahmen alle zutreffen:

• Gleiche molekulare Konformation
• Proteinproben sind perfekt globulär, wie die globulären Proteinstandards
• Polymerproben haben die gleiche Architektur wie der Polymerstandard, z.B. lineare Random-Coil-Struktur
• Gleiche Dichte / gleiches Spezifisches Volumen
• Säulen-Wechselwirkungen
• Enthalpische Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase, wie z. B. elektrostatische oder hydrophobe Wechselwirkungen, sind vernachlässigbar
• Die Trennung erfolgt einzig nach der hydrodynamischen Größe

Außerdem altern SEC-Säulen mit der Zeit und müssen deshalb regelmäßig neu kalibriert werden.

SEC-MALS ist absolut

SEC-MALS bietet eine Analyse basierend auf physikalischen Grundprinzipien die unabhängig von den Annahmen der Säulenkalibrierkurve sind.

• Grundlegende physikalische Gleichungen setzen die molare Masse in Beziehung mit der Streulichtintensität gemessen mit MALS und der Konzentration gemessen mit UV oder dRI.
• Die Analyse hängt nicht von der Molekülform/Konformation ab und wird nicht durch nicht-ideale Säuleninteraktionen beeinflusst.
• Die molare Masse wird bei jedem Elutionsvolumen gemessen, typischerweise einmal pro Sekunde. Ist das Molekül groß genug kann auch sein rms-Radius gemessen werden.

SEC-MALS bestimmt die molare Masse von 200 g/mol bis 1 billion g/mol. SEC-MALS kann auch die Molekülgröße als rms-Radius oder Gyrationsradius R_g von 10 nm bis 500 nm und darüber hinaus bestimmen. Durch die Kombination von molarer Masse und Größe lässt sich ebenfalls die Konformation eines Moleküls beurteilen. Und MALS-Detektoren müssen nur einmal jährlich kalibriert werden.

SEC-MALS charakterisiert komplexe Analyten

Komplexe Makromoleküle sind für die Standard-SEC-Analyse unter Umständen gar nicht zugänglich. SEC-MALS charakterisiert viele von ihnen und liefert Informationen, die über die molare Masse und Größe hinausgehen:

• Konjugierte Moleküle (Glykoproteine, PEGylierte Proteine, Copolymere) – Zusammensetzung von Konjugaten, molare Masse der einzelnen Komponenten
• Verzweigte Polymere – Verzweigungsverhältnis
• Nicht-globuläre Proteine einschließlich inhärent ungeordneter und denaturierter Proteine, Oligomere und durch Tenside solubilisierte Membranproteine
• Oligomere, Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Komplexe – absolute Stöchiometrie und nativer oligomerer Zustand

Molare Masse, Größe und Konformation sind wesentliche physikalische Eigenschaften von Makromolekülen. Wissenschaftler, die sich nicht mit „einer Antwort“ zufrieden geben, sondern „die Antwort“ auf ihre Charakterisierungsherausforderungen benötigen, setzen auf Wyatt MALS-Geräte und -Software, die für Zuverlässigkeit und Vertrauen stehen.

In akademischen, staatlichen und anderen Laboren, die Grundlagenforschung betreiben, wird SEC-MALS im großen Umfang für die Charakterisierung von Proteinen und Polymeren eingesetzt.

In der biopharmazeutischen Industrie und im Bereich der Hochleistungsmaterialien wird SEC-MALS in F&E- und Analyselaboren für die Bewertung von Lösungseigenschaften sowie für Stabilitätstests, Prozessentwicklung, Zulassungsanträge und Qualitätskontrolle eingesetzt.

Bei SEC-MALS besteht die Funktion der SEC-Säule darin, die Lösungskomponenten nach ihrer hydrodynamischen Größe zu trennen. Aufgrund von Wechselwirkungen mit der Säule können einige Komponenten in umgekehrter Reihenfolge eluieren, und Komponenten gleicher Größe können zu unterschiedlichen Zeiten eluieren.

Während jede Komponente die Detektoren durchläuft, werden ihre Konzentration und Lichtstreueigenschaften etwa jede Sekunde gemessen. Bei UHP-SEC-MALS sind die Peaks viel schmaler, so dass die Daten etwa 10 Mal pro Sekunde erfasst werden.

Der MALS-Detektor enthält zwischen 3 und 18 Photodioden, die in verschiedenen Winkeln θ relativ zum Laserstrahl positioniert sind, um die Streulichtfunktion R(θ) zu messen. An jedem Datenpunkt:

1. Der Plot von Streulichtintensität vs. Winkel wird gefittet, um R₍₀₎ den y-Achsenabschnitt bei Winkel θ = 0 und die Steigung zu bestimmen.
2. Die molare Masse M_w wird aus dem Verhältnis von R₍₀₎ und der Konzentration berechnet
3. Der Gyrationsradius R_g wird aus der Steigung des Fits berechnet.

Ein Großteil der Konstanten, die zur Bestimmung von M_w und R_g verwendet werden, hängen mit den optischen Eigenschaften des Systems zusammen, wie z. B. der Wellenlänge des Lasers und dem Brechungsindex des Lösungsmittels, bzw. (der mobilen Phase). Außerdem muss der dn/dc-Wert (das Spezifische Brechungsindexinkrement) des Analyten in der mobilen Phase bekannt sein oder gemessen werden. Dies ist einfacher als es klingt! Weitere Details zur Theorie von MALS finden Sie auf unserer MALS Theorie Seite.

Wenn SEC-MALS unzureichend ist

SEC-MALS ist nur dann effektiv, wenn eine gute Trennung auf der SEC-Säule erreicht wird. Wenn das nicht funktioniert, entweder aufgrund von Analyt-Säulen-Wechselwirkungen oder einfach aufgrund von Analyten außerhalb des Größenbereichs von SEC, kann MALS mit einer anderen Trenntechnik gekoppelt werden, wie z. B. der Feldflussfraktionierung. Auf der FFF-MALS Seite erfahren Sie mehr.

MALS kann auch mit Ionenaustausch-Chromatographie (IEX-MALS) und Reverse-Phase-Chromatographie (RPC-MALS) kombiniert werden, die im Gegensatz zu SEC nicht kalibriert werden können, um einer bestimmten Retentionszeit einer molaren Masse zuzuordnen. Online-MALS Analysen ermöglichen die sofortige Identifizierung von Peaks, ohne dass Fraktionen gesammelt und im Nachhinein analysiert werden müssen. Erfahren Sie mehr über diese und andere Arten von MALS-Messungen in unseren Application Notes für andere Techniken.

Basis System

Für eine einfache SEC-MALS-Analyse benötigen Sie lediglich ein Standard-HPLC- oder FPLC-System einschließlich eines Konzentrationsdetektors (UV für Proteine, dRI für Polymere), SEC-Säule(n), ein MALS-Gerät und einen Computer mit ASTRA^™-Software für die Datenaufnahme und -analyse.

• HP/FPLC-SEC-MALS verwendet einen DAWN^™- oder miniDAWN^™-MALS-Detektor; für UHP-SEC-MALS ist ein microDAWN^™ erforderlich.
• Das DAWN hat 18 Detektorwinkel; es deckt einen Molmassenbereich von 200 bis 10⁹ g/mol und einen Radienbereich von 10 bis 500 nm mit maximaler Sensitivität ab.
• miniDAWN und microDAWN haben 3 Detektorwinkel; sie decken einen Molmassenbereich von 200 bis 10⁷ g/mol (bzw. 10⁶ g/mol für lineare Polymere) und einen Radienbereich von 10 bis mindestens 50 nm ab.
• Der MALS-Detektor wird dem UV-Detektor nachgeschaltet und/oder dem dRI-Detektor vorgeschaltet.
• Probeninjektion und Start der ASTRA-Datenerfassung werden über ein analoges Autoinjektionssignal synchronisiert. Die Konzentrationsdaten werden über den Analogausgang des Konzentrationsdetektors erfasst. Zur Steuerung des HPLC-Systems wird die systemeigene HPLC-Software oder ein Handheld-Controller verwendet.

Standard System

Die meisten SEC-MALS-Anwender finden es vorteilhaft, einen Optilab^™ (dRI-Detektor) oder einen microOptilab^™ für UHPLC einzubinden.

• Proteinanalyse - die Einbeziehung eines Optilab ist sehr nützlich, da nahezu alle Proteine den gleichen (dn/dc) haben. Es ist nicht notwendig, den Extinktionskoeffizienten jedes einzelnen Peaks zu kennen.
• Biokonjugate - MALS, UV und dRI werden kombiniert für die Analyse von Glykoproteinen, AAV's, Protein/DNA-Komplexen, Membranproteinen, die mit Tensiden oder Lipiden stabilisiert sind, und anderen Biomakromolekülen, die aus zwei unterschiedlichen Komponenten bestehen. Die gleiche Analyse ist für viele Copolymere geeignet.
• Polymeranalyse - das Ersetzen des dRI-Detektors der HPLC durch ein Optilab bietet viele Vorteile wie direkte digitale Datenerfassung, übereinstimmende MALS- und dRI-Wellenlängen für genauere Molmassenbestimmung und einen Konzentrationsbereich bis ~ 20 mg/mL für praktische und genaue dn/dc-Messungen.

Volle Systemkontrolle

Die ASTRA-Software kann ausgewählte HPLC-Geräte direkt steuern, so dass eine Synchronisation der ASTRA-Methode mit der systemeigenen HPLC-Software nicht erforderlich ist. Bitte kontaktieren Sie info@wyatt.eu für die aktuelle Liste der unterstützten HPLC- und UHPLC-Komponenten. Wir rufen Sie auch gerne zurück, so dass Sie die Anforderungen mit einem Applikationsspezialisten im Detail besprechen können.

Erweitertes System

Zusätzliche Wyatt-Produkte eröffnen erweiterte Charakterisierungsmöglichkeiten:

• Proteine und Nanopartikel – die meisten Proteine und einige Nanopartikel fallen unter die untere Grenze für die Bestimmung von R_g. Dies verhindert nicht die Bestimmung der molaren Masse. Ein Wyatt-QELS-Modul für Dynamische Lichtstreuung kann in den MALS-Detektor integriert werden, um hydrodynamische Radien bis hinunter zu 0,5 nm zu bestimmen. Das ist ideal für die meisten Proteine und Peptide. Alternativ kann ein DynaPro^™ NanoStar oder <DynaPro^™ ZetaStar^™ über ein Lichtleiterkabel an die MALS-Flusszelle angeschlossen werden, um als Online-DLS-Detektor zu dienen.
• Polymere – viele Polymere sind ebenfalls zu klein für die R_g Analyse, auch wenn MALS keine Schwierigkeiten hat ihre molare Masse zu bestimmen. Zur Analyse von Größe, Konformation und Verzweigung solch kleiner Moleküle wird ein ViscoStar^™-Differenzialviskosimeter hinzugefügt, bzw. ein (microViscoStar^™ für UHPLC. SEC-MALS-IV bestimmt die Mark-Houwink-Sakurada-Parameter für die Konformationsanalyse und den hydrodynamischen Radius.
• Herausfordernde Polymere – das ViscoStar kann ohne MALS, in SEC-IV-Konfiguration, für die Analyse von Polymeren verwendet werden, die nicht für Lichtstreuung geeignet sind. Dazu gehören z. B. stark fluoreszierende Lignine, Materialien, die bei der MALS-Wellenlänge stark absorbieren, oder Polymer-Lösungsmittel-Systeme ohne Streuung (dn/dc = 0).

Targetproteine und Proteinreagenzien

SEC-MALS charakterisiert Proteine und andere Biomoleküle hinsichtlich ihrer Eigenschaften in Lösung, einschließlich der molaren Masse des Moleküls und seiner löslichen Aggregate, unabhängig von der Konformation oder nicht-idealen Säuleninteraktionen. Dies ist vorteilhaft für die schnelle Identifizierung optimaler Aufreinigungsbedingungen und kann ein Schlüsselindikator für die Funktionsfähigkeit von Reagenzproteinen sein, die in verschiedenen Assays verwendet werden.

Die Bedeutung von SEC-MALS für die Qualitätskontrolle von ELISA-Reagenzien wird untersucht in AN1606: Assessing ligand-binding assay reagent proteins.

Aggregation, Charakterisierung und Qualitätsattribute

SEC-MALS ist die bevorzugte Methode zur Charakterisierung von löslichen Aggregaten von Biopharmazeutika für Zulassungsanträge. Sie hat sich sowohl beim Vergleich von Chargen aus verschiedenen Prozessen als auch beim Vergleich von Biosimilars mit Originalwirkstoffen bewährt.

Um mehr über die Grundlagen der SEC-MALS-Analyse von Proteinen zu erfahren, laden Sie unser White Paper herunter: WP1615: SEC-MALS for absolute biophysical characterization.

Gentherapie: RNA, VLP's und AAV's

Kleine Viren wie AAVs sowie virusähnliche Partikel und Nukleinsäuren, die sich mit SEC trennen lassen, können mit SEC-MALS auf kritische Qualitätsattribute wie molare Masse, Aggregation, Titer und Verhältnis von nukleinsäurehaltigen zu leeren Kapsiden charakterisiert werden.

Siehe AN1617: AAV critical quality attribute analysis by SEC-MALS und AN1616: SEC-MALS methods for characterizing mRNA for essential SEC-MALS applications in small viral vectors.

Oligomerisierung

Einige Biologika, wie z.B. Insulin, müssen für optimale Stabilität und Wirksamkeit in einer wohldefinierten oligomeren Form vorliegen. SEC-MALS identifiziert eindeutig die Oligomere, die in verschiedenen Formulierungen vorhanden sind.

Die SEC-MALS-Analyse der Insulin-Oligomerisierung in verschiedenen Formulierungen wird untersucht in AN1605: Identification of insulin oligomeric states.

Konjugate

Post-translationale Modifikationen wie Glykosylierung oder PEGylierung werden häufig an Proteinen oder Peptiden vorgenommen, um die Stabilität zu verbessern und die physiologische Verweildauer zu erhöhen. Protein-Polysaccharid-Impfstoffe sind ein weiterer häufiger Typ von konjugierten Biopharmazeutika. Triple-Detektion-SEC-MALS kombiniert UV-, MALS- und RI-Instrumente, um den Grad der Glykosylierung oder PEGylierung oder die Molekulargewichtsverteilung von konjugierten Polysacchariden und die Anzahl von Proteinen pro Molekül zu bestimmen. In einigen Fällen kann SEC-MALS verwendet werden, um das Drug-Antibody-Ratio (DAR, = Wirkstoff-Antikörper-Verhältnis) von Antibody-Drug-Conjugates (ADCs, = Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten) zu berechnen.

Siehe AN1612: Protein PEGylation processes characterized by SEC-MALS um zu erfahren, wie diese Technik bei der Entwicklung von PEGylierungsprozessen eingesetzt wird.

Therapeutische Biopolymere

Heparin, Hyaluronsäure und andere Polymere, die von Tieren stammen, können sehr variabel sein und müssen sorgfältig mit SEC-MALS charakterisiert werden, um Qualitätskenngrößen in Bezug auf Molmassenverteilungen und Konformation zu definieren.

AN6301: Discriminating heparin from chondroitin sulfate by charge:mass ratio erklärt, wie SEC-MALS mit der Ladungsanalyse kombiniert wird, um Produktidentität und -qualität sicherzustellen.

 Weitere Biopharmazeutische Applikationen

 Webinare zur Biopharmazeutischen Charakterisierung

Identifizierung und Qualität von Proteinen

Die molare Masse ist der Schlüssel zur Identifizierung von Proteinen, ihrer Oligomere oder Komplexe. Dennoch verlassen sich allzu viele Forscher auf eine potenziell ungültige Analyse des Molekulargewichts durch native PAGE oder traditionelle Größenausschlusschromatographie (SEC). Diese Techniken berufen sich auf Annahmen von Konformation und idealen Matrix-Interaktionen, die Forscher zu einer grundlegend ungenauen Interpretation ihrer Daten für wissenschaftliche Publikationen führen können. SEC-MALS stellt eine exakte, auf physikalischen Grundprinzipien beruhende Analyse der molaren Masse dar, die sich nicht auf Retentionszeiten oder Kalibrierung mit Referenzmolekülen stützen muss. Die einzige Funktion der SEC-Säule ist die Trennung der Moleküle nach ihrer Größe, während MALS unabhängig davon die molare Masse der eluierenden Proteine bestimmt.

Um mehr über die Grundlagen der SEC-MALS-Analyse von Proteinen zu erfahren, laden Sie unser White Paper herunter: WP1615: SEC-MALS for absolute biophysical characterization.

Membranproteine und Glykoproteine

Mit Detergenz solubilisierte Membranproteine sind aufgrund der Tensidmizelle, die das Protein umgibt, mit traditionellen Techniken oder sogar mit Massenspektrometrie besonders schwierig zu analysieren. Denaturierendes SDS-PAGE dissoziiert native Oligomere und schließt deren Identifizierung aus, während die Crosslinking-Massenspektrometrie Oligomere erzeugen kann, die in Lösung nicht existieren.

Stark glykosylierte Proteine können nicht durch Referenzstandards oder gängige Modelle für globuläre Proteine dargestellt werden und sind daher für die Analyse mit traditionellen Techniken nicht geeignet.

Diese Herausforderungen werden durch SEC-MALS gemeistert. Dabei kann zwischen einem Protein und dem assoziierten Detergenz oder Kohlenhydrat unterschieden werden, indem Daten von drei Detektoren kombiniert werden: UV, MALS und dRI. ASTRA's „Conjugate Analysis“-Algorithmus zur Konjugatanalyse berechnet die molaren Massen sowohl der Protein-Komponente als auch der ankonjugierten oder mizellaren Komponente. Der wahre oligomere oder komplexierte Zustand des Proteins sowie der Grad der Glykosylierung werden eindeutig bestimmt.

AN1602: Characterizing lipid membrane protein complexes by SEC-UV-MALS-dRI zeigt ein Beispiel der Analyse des Protein- und Gesamtgehalts eines Komplexes, der ein Membranprotein und Lipide zur Solubilisierung enthält.

Aufreinigung & Aggregate

Wissenschaftler, die detaillierte mechanistische Studien von Proteinen und ihrer biologischen Funktion durchführen, können es sich nicht leisten, mit Material schlechter Qualität zu arbeiten. SEC-MALS ist ein grundlegendes Werkzeug, um die Qualität und Reinheit von Proteinproben zu beurteilen. SEC-MALS ermöglicht echte Trennungen mit absoluten Molmassenmessungen, um zu verstehen, welche Proteine und Abbauprodukte in der Lösung vorhanden sind.

SDS-PAGE kann hinsichtlich der Proteinqualität recht irreführend sein, aber SEC-MALS liefert das wahre Bild in der Applikationsnote AN1603: Protein Reagent Quality for Drug Discovery.

Oligomerisierung und Komplexbildung

Die meisten biologischen Oligomere befinden sich in einem dynamischen Gleichgewicht mit dem Monomer. Der Grad der Oligomerisierung hängt von der Konzentration sowie dem pH-Wert des Puffers und der Ionenstärke ab. Daher muss die korrekte Identifizierung eines nativen Oligomers vollständig in Lösung erfolgen.

SEC-MALS liefert eine erste Diagnose der Oligomerisierung, wenn die molare Masse eines Proteins signifikant vom Sequenzgewicht des Monomers abweicht oder die Masse über den Elutionspeak je nach Konzentration variiert. Eine Verifizierung kann durch einige zusätzliche SEC-MALS-Messungen mit unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen oder Injektionsvolumina erreicht werden.

Sehen Sie sich diese Webinare an, um ein tieferes Verständnis dafür zu erhalten, wie SEC-MALS Protein-Oligomere und Protein-Komplexe analysiert:

Understanding Absolute Stoichiometry of Oligomeric Protein Complexes Using SEC-MALS

Applications of Analytical Light Scattering in a Biophysics Core Facility

Characterizing Protein-Nucleic Acid Interactions by Light Scattering

Applications of Light Scattering to HIV Integrase Structural Biology and Drug Discovery

Absolute Characterization of Glycoproteins and their Interactions with Proteins and Antibodies by Light Scattering

 Weitere Protein-Applikationen

 Webinare zur Proteincharakterisierung

Verzweigungsanalyse

Die langkettige Verzweigung ist eine der wichtigsten Eigenschaften, die sich auf die Performance von Polymermaterialien auswirkt. SEC-MALS und SEC-MALS-IV sind am besten für kleine und mittelgroße Polymere geeignet, während FFF-MALS eine exzellente Trennung und Charakterisierung großer und stark verzweigter Makromoleküle ermöglicht.

Die Theorie und Applikationen von Lichtstreuung und Differentialviskosimetrie in der Verzweigungsanalyse werden in WP1003: Branching revealed: Characterizing molecular structure in synthetic polymers by multi-angle light scattering und im Webinar Branching Revealed: Characterizing Molecular Structure in Synthetic and Natural Polymers by Multi-Angle Light Scattering näher beleuchtet.

Kurzkettige Verzweigung

Lang- und kurzkettige Verzweigungen beeinflussen die Materialeigenschaften auf grundlegend unterschiedliche Weise. Mit SEC-MALS und SEC-MALS-IV können diese beiden Parameter voneinander unterschieden und charakterisiert werden.

Laden Sie für nähere Informationen unsere Applikationsnote herunter: AN1005: Identifying short-chain branched polymers with conformational analysis.

Lignin und Lignosulfonat

Die Analyse von Lignin und Lignosulfonat gehört zu den anspruchsvollsten Anwendungen von SEC-MALS und FFF-MALS. Die absolute Molmassenverteilung wird erfolgreich über FFF-MALS charakterisiert, unterstützt durch die erweiterten technischen Funktionen des DAWN und der Eclipse.

Applikationen von MALS für Lignin und Lignosulfonat werden in WP2303: Lignin and lignosulfonate characterization with SEC-MALS and FFF-MALS besprochen, während Anwendungen für Lignocellulose-haltige Materialien im Webinar Pulp Non-Fiction: Absolute Macromolecular and Nanoparticle Characterization of Lignocellulosic Materials behandelt werden.

PLGA

Anhand von Verzweigungen werden die pharmakokinetischen und mechanischen Eigenschaften sowie die Bioabbaubarkeit von PLGA eingestellt. Die Charakterisierung von verzweigtem PLGA durch konventionelle Größenausschlusschromatographie (SEC) leidet unter dem Mangel an geeigneten Kalibrierungsstandards, was jedoch für SEC-MALS kein Hindernis darstellt.

Lesen Sie, wie PLGA-Proben mit SEC-MALS-IV analysiert wurden, um die absolute Molmassenverteilung und Konformation zu bestimmen, in AN1301: Characterization of PLGA using SEC-MALS-IV. Um mehr über die Charakterisierung von PLGA für die Zulassung von Generika zu erfahren, sehen Sie sich das Webinar Using SEC-MALS-IV to Characterize PLGA for FDA Generic Drug Approval an.

Hyaluronsäure

Das physiochemische Verhalten von Hyaluronsäure ist eng mit Materialeigenschaften wie dem gewichtsmittleren Molekulargewicht, der Polydispersität, der intrinsischen Viskosität und der molekularen Konformation verbunden. Differenzielle Viskosimetrie wird in Kombination mit SEC-MALS verwendet, um Hyaluronsäure aus einer Vielzahl von Quellen zu analysieren. Das führt zu einem detaillierten Verständnis der Eigenschaften.

Siehe AN1302: Characterization of hyaluronic acid with online multi-angle light scattering and differential viscometry.

Charakterisierung von Polymeren mit Lichtstreuung und UHP-SEC

UHP-SEC bietet zahlreiche Vorteile für die Charakterisierung synthetischer Polymere, ist aber empfindlicher gegenüber Säulenkalibrierungsfehlern als die traditionelle HP-SEC. In Verbindung mit MALS bestimmt UHP-SEC genau und zuverlässig das Molekulargewicht, die Größe und die Konformation von Polymeren im Bereich von Hunderten bis Millionen g/mol. Dabei sind eine hohe Auflösung und Empfindlichkeit sowie ein geringer Lösungsmittelverbrauch gewährleistet.

Die Vorteile von UHP-SEC-MALS werden erklärt in WP1004: Absolute characterization of polymers with light scattering and UHP‐SEC. Ein neuartiges Online-Mikroviskosimeter für die UHP-SEC-Analyse wird im Webinar Development of a New Online Micro-Viscometer for APC and UHPLC Applications beschrieben.

 Weitere Biopolymer-Applikationen

 Weitere Applikationen für synthetische Polymere

 Webinare zur Polymercharakterisierung

Die Durchführung einer SEC-MALS-Messung ist der Standard-SEC sehr ähnlich. Sie umfasst:

1. Probenvorbereitung (minimal)
2. Säulen-Equilibrierung
3. Probe(n) in einen manuellen Injektor oder einen Autosampler laden
4. Injizieren der Probe und Datenaufnahme
5. Analysieren der Daten

Wenn Sie einen Autosampler haben, können Sequenzen für eine ganze Reihe automatisierter Injektionen erstellt werden, die dann während des Arbeitstages und über Nacht erfolgen können.

Es gibt zwei Hauptunterschiede im Arbeitsablauf im Vergleich zur Standard-SEC: die Verwendung von ASTRA für die Datenanalyse und einige zusätzliche Vorkehrungen zur Minimierung von Partikeln im System für hochwertige Lichtstreumessungen.

Lichtstreuung ist besonders empfindlich gegenüber Partikeln, die normalerweise die Hauptquelle des Rauschens im MALS-Signal sind und in den UV- und dRI-Signalen nicht sichtbar sind. Die Entfernung von Partikeln aus Proben und Lösungsmitteln ist nicht schwierig, erfordert jedoch einige Sorgfalt und Anpassung im Vergleich zu reinen SEC-Protokollen.

• Die mobile Phase sollte mit 0,1 µm filtriert werden, obwohl auch mit den gebräuchlicheren 0,22 µm-Filtern akzeptable Ergebnisse erzielt werden können. Zusätzlich wird dem System zwischen Pumpe und Injektionsschleife ein 0,1 µm-Filter hinzugefügt. Bei UHP-SEC-MALS ist der Reinheitsgrad, der für UHPLC-Systeme allgemein erforderlich ist, in der Regel ausreichend für gute MALS-Ergebnisse und eine zusätzliche Filtration ist meist nicht erforderlich.
• Die Säulen müssen gut gepflegt werden. Es sollte eine Säule mit minimalem Säulenbluten gewählt werden. Wyatt bietet SEC-Säulen an, die für die Lichtstreuung optimiert sind und kein Säulenbluten zeigen. Dies bewirkt eine schnelle Equilibrierung und ein geringes Basislinienrauschen.
• Die Proben sollten mit der geringsten Filterporengröße filtriert werden, die den interessierenden Analyten nicht entfernt.

Ist mein System sauber?

Nach dem Spülen und Equilibrieren der SEC-Säule ist es mitunter nicht direkt offensichtlich, ob das System ausreichend partikelfrei für hochwertige MALS-Messungen ist. Der „System Health Monitor“ auf dem Display des DAWN, miniDAWN und microDAWN zeigt Ihnen deshalb an, ob der Rauschpegel niedrig genug ist, um gute Daten zu erzeugen.

Die ASTRA-Software ist in vielerlei Hinsicht wie eine typische Chromatographie-Software aufgebaut. Da sie jedoch MALS-Daten erfasst und analysiert, gibt es wichtige Unterschiede bei den Verfahren und Berechnungen.

• Kalibrierung – während die Standard-SEC eine häufige Kalibrierung mit analytspezifischen Standards erfordert, wird der MALS-Detektors üblicherweise nur einmal pro Jahr kalibriert, wobei reines Toluol verwendet wird. Das Optilab und das ViscoStar benötigen keine Kalibrierung.
• Bandenverbreiterungskorrektur und Normalisierung – diese Prozeduren ermitteln bestimmte Systemparameter, die für Multi-Detektor-SEC und Lichtstreuung erforderlich sind. Die Parameter werden bestimmt durch Messung einer beliebigen bekannten monodispersen Probe mit R_g < 10 nm, bei der vorzugsweise der Wert für R_g bekannt ist. Die molare Masse und die Konzentration werden nicht benötigt. Diese Prozeduren werden typischerweise alle ein bis zwei Wochen durchgeführt, solange sich die mobile Phase nicht ändert. Die meisten wässrigen Lösungsmittel können für diesen Zweck als gleich angesehen werden.
• „Bridge Balancing“ – die Kapillarbrücke des ViscoStar wird mit der reinen mobilen Phase ausbalanciert. Der Vorgang ist vollautomatisch und dauert nur wenige Minuten. typischerweise wird dies täglich oder wöchentlich durchgeführt.

Im täglichen Betrieb müssen dann nur noch Basislinien gesetzt, Peaks ausgewählt und die Ergebnisse protokolliert werden. Das Setzen der Basislinien und Peaks kann in ASTRA sogar automatisiert werden. Das entlastet den Benutzer von diesem Aufwand, wenn mehrere Dateien zu analysieren sind. ASTRA stellt außerdem die wichtigsten, durch den Benutzer festgelegten Ergebnisse aus mehreren Läufen in Tabellen und Grafiken zusammen für eine bequeme Berichterstellung. Der endgültige Bericht kann an unterschiedliche Anforderungen angepasst werden.

Für Anwender in GMP/GLP-regulierten Umgebungen ermöglicht das ASTRA Security Pack Add-on das Messen unter „CFR 21 Part 11“-Compliance, einschließlich vollständiger Audit-Trails und elektronischer Signaturen.

ASTRA unterstützt Nutzer bei der Berechnung von Peak-Statistiken, beim Vergleich mit konventionellen Kalibriermethoden und bei der Qualitätsbeurteilung der Chromatographie.

Darüber hinaus bietet ASTRA viele weiterführende Analysen zur Unterstützung einer Vielzahl von Applikationen, wie z. B. die Analyse von Proteinkonjugaten, Verzweigung, viralen Vektoren und Partikelkonzentration.

Wyatt Technology bietet diverse Angebote zur Unterstützung von Anfängern und fortgeschrittenen Anwendern, einschließlich Übungsanleitungen, Schulungsmaterialien und sogenannten Technical Notes online im Wyatt Support Center, Telefonsupport und die Light Scattering University. Besuche bei Ihnen vor Ort können für IQ/OQ, Service und präventive Wartungen sowie für Gruppenschulungen vereinbart werden.

DAWN^™ - Der empfindlichste MALS-Detektor, der auf dem Markt erhältlich ist. Beinhaltet 18 Detektorwinkel zur Bestimmung von molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 1 GDa und Radien von 10 bis 500 nm.

• Standardmodell: Umgebungstemperatur
• Heiz-/Kühl-Option: -15 °C bis +150 °C
• Hochtemperatur-Option: Umgebungstemperatur bis +210 °C

Das DAWN bietet auch spezielle Optionen für die Messung fluoreszierender Proben: Interferenzfilter und einen Infrarot-Laser bei 785 nm. Erfahren Sie mehr.

miniDAWN^™ - Hat die zweithöchste Empfindlichkeit nach dem DAWN, entwickelt für kleinere Makromoleküle. Es besitzt 3 Detektorwinkel zur Bestimmung von molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 10 MDa und Radien von 10 bis 50 nm. Eine Temperaturkontrolle ist nicht erhältlich. Erfahren Sie mehr.

microDAWN^™ - Der erste MALS-Detektor für UHPLC, mit einer Interdetektor-Dispersion von nur 1,5 µL. Er besitzt 3 Detektorwinkel zur Bestimmung von molaren Massen im Bereich von 200 Da bis 10 MDa und Radien von 10 bis 50 nm. Eine Temperaturkontrolle ist nicht erhältlich. Erfahren Sie mehr.

Optilab^™ - Ein einzigartiges Online-Differenzialrefraktometer zur Konzentrationsmessung beliebiger Makromoleküle, unabhängig von Chromophoren. Temperaturkontrolle ist einstellbar von 4 °C bis 65 °C. Die Hochkonzentrationsoption unterstützt Proteinkonzentrationen von bis zu 180 mg/mL. Erfahren Sie mehr.

microOptilab^™ - Der erste dRI-Detektor, der speziell für die Verwendung mit allen UHPLC-Systemen entwickelt wurde. Erfahren Sie mehr.

ViscoStar^™ - Ein hochempfindliches Online-Differenzialviskosimeter, das in Verbindung mit SEC-MALS zur Bestimmung der Größe und Konformation aller Arten von Biopolymeren, synthetischen Polymeren und sogar Proteinen und Peptiden verwendet wird.

Das ViscoStar beinhaltet mehrere neuartige Technologien, womit es die höchste Empfindlichkeit, Stabilität und Lösungsmittelkompatibilität aller auf dem Markt verfügbaren Viskosimeter für die SEC/GPC bietet. Seine Benutzerfreundlichkeit und die einfache Wartung machen ihn zur perfekten Ergänzung zu den DAWN^® Lichtstreudetektoren und Optilab^® Brechungsindexdetektoren von Wyatt. Die Temperaturkontrolle ist einstellbar von 4 °C bis 70 °C. Erfahren Sie mehr.

microViscoStar^™ - Ähnlich wie das ViscoStar, aber speziell für den Einsatz mit UHPLC/APC entwickelt. Erfahren Sie mehr.

WyattQELS^™ - Modul für Dynamische Lichtstreuung, das in jedes Wyatt MALS-Instrument als Online-DLS eingebettet werden kann.

DynaPro™ NanoStar™ II - Stand-Alone-Detektor für Dynamische Lichtstreuung, kann über ein Lichtleiterkabel an die Flusszelle eines beliebigen Wyatt MALS-Instruments als Online-DLS angeschlossen werden.

Mobius™ - Stand-Alone-Detektor für Dynamische und Elektrophoretische Lichtstreuung, kann über ein Lichtleiterkabel an die Flusszelle eines beliebigen Wyatt-MALS-Instruments als Online-DLS angeschlossen werden.

ASTRA^™ – Umfassende Analyse von SEC-MALS-Messungen zur Bestimmung von Molmassenverteilungen, Größenverteilungen und Konformation. Analysiert auch Daten von Online-DLS und Intrinsischer Viskosität (IV). Zum vollständigen Satz der ASTRA-Analysen gehören u. a. folgende spezielle Funktionen:

• Protein-Konjugat-Analyse – analysiert Konjugate und Komplexe aus zwei Komponenten, um die molare Masse jeder Komponente zu bestimmen.
• AAV CQAs – bestimmt kritische Qualitätsattribute (CQAs) wie die Aggregation, den Titer und das Verhältnis von leeren und mit DNA gefüllten von Adeno-assoziierten Viren, die für die Gentherapie verwendet werden.
• Polymerverzweigung – nutzt das Größen-Molmassen-Verhältnis der Probe und ein lineares Analogon zur Bestimmung des Verzweigungsverhältnisses.
• Mark-Houwink-Sakurada-Analyse – bestimmt die MHS-Parameter aus gleichzeitig aufgenommenen MALS-, dRI- und IV-Signalen.
• Partikelkonzentration – bestimmt die momentane Partikelkonzentration (Partikel/mL) bei jedem einzelnen Datenpunkt.

Das Security Pack Add-on ermöglicht das Arbeiten unter „CFR 21 Part 11“-Compliance, einschließlich vollständiger Audit-Trails und elektronischer Signaturen.

Bei jedem Gerätekauf bieten wir eine Vor-Ort-Installation und Einarbeitung in Ihrem Labor an, um die ordnungsgemäße Einrichtung und Funktion des Geräts sicherzustellen. Außerdem bieten wir Ihnen eine auf Ihre speziellen Bedürfnisse zugeschnittene Vor-Ort-Schulung an. Diese zusätzlichen Dienstleistungen können besonders dann erwünscht sein, wenn eine große Gruppe von Mitarbeitern geschult werden soll.

Alle neuen Wyatt-Geräte kommen mit einem Jahr unbegrenztem Telefon- und E-Mail-Support sowie unserer Standard-Vollgarantie während des ersten Jahres. Unser freundliches Team aus erfahrenen Laboranten und promovierten Wissenschaftlern bietet sowohl technische als auch anwendungsspezifische Unterstützung. Wir zeigen Ihnen per Fernzugriff auf Ihren PC, wie Sie Ihre Daten analysieren oder die Gerätekommunikation einrichten.

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Die Besonderheiten des Service im ersten Jahr sowie des fortlaufenden Supports können je nach Region variieren. Bitte kontaktieren Sie Ihren lokalen Wyatt-Ansprechpartner für weitere Informationen.

Wyatt Technology bietet ein komplettes Compliance-Programm einschließlich Dokumentation und Vor-Ort-Validierung für alle Geräte. Wir stellen die notwendigen Ressourcen und Werkzeuge zur Verfügung, um die Compliance sicherzustellen. Wir haben intensiv mit unseren Partnern in GxP-konformen Umgebungen zusammengearbeitet, um ein robustes Set an Dokumenten und Dienstleistungen aufzubauen. Geräte und Software von Wyatt werden in GMP-Umgebungen in der Pharma- und Biotech-Industrie sowie in anderen regulierten Branchen auf der ganzen Welt eingesetzt. Erfahren Sie mehr über unser Compliance-Programm.

Unser Vorzeige-Schulungsprogramm Light Scattering University^® (LSU) ist bei jedem Kauf eines Lichtstreugeräts enthalten. In dem 2-, 3- oder 4-tägigen Kurs - je nachdem, welches System gekauft wird - lernen die LSU-Teilnehmer fortgeschrittene Datenverarbeitungsmethoden und alternative Analysefunktionen kennen, mit denen sie vielleicht noch nicht vertraut sind. Die Teilnehmer lernen auch, wie ihre MALS- und DLS-Daten Informationen aus anderen Techniken, die sie im Labor verwenden, ergänzen. Für LSU-Absolventen werden Fortgeschrittenenkurse zu detaillierteren Techniken und Themen angeboten.

Die Kurse gehen über mehrere Tage in Vollzeit. Dafür lernen Sie nicht nur viel über Lichtstreuung, sondern können auch nach einem erfolgreichen Kurstag das gelernte noch einmal beim Abendessen mit einem Wyatt-Mitarbeiter besprechen.

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Wir bei Wyatt wissen, dass Ausfallzeiten und Produktivitätsverluste kritisch sind. Daher haben wir drei umfassende Servicepläne entwickelt: Gold-, Silber- und Bronze-Servicepläne. Sie sind speziell darauf ausgerichtet, die jährliche präventive Wartung und Reparaturanfragen von Geräten schnell, reibungslos und nach den Bedürfnissen unserer Kunden durchzuführen. Diese Pläne sind auf jährlicher Basis nach Ablauf der einjährigen Gerätegarantie erhältlich und bieten fortlaufenden, unbegrenzten Telefonsupport, E-Mail-Support und Geräteservice.

Der „Gold Service Plan“ bietet umfassende präventive Wartungs- und Reparaturleistungen vor Ort. Ein hochqualifizierter Wyatt-Mitarbeiter kommt zu Ihnen und führt die jährliche präventive Wartung, Kalibrierung und Requalifizierungsprüfung durch und organisiert bei Bedarf auch weitere Schulungen. Unsere engagierten Außendienstkoordinatoren verwalten den Serviceplan für das Gerät, damit Sie sich auf Ihre Forschung konzentrieren können. Wir bieten auch Leihgeräte an, falls ein Gerät nicht vor Ort repariert werden kann.

Mit unserem „Silber Service Plan“ bieten wir Ihnen vollständige Gerätekalibrierung und Qualitätskontrolltests, einen priorisierten Service inklusive Teilen, Arbeitszeit, Versand und bei Bedarf Hardware-Updates an. Hierzu wird das Gerät zu uns geschickt. Daneben werden aber bei technischem und Anwendungs-Support per Telefon, E-Mail und Screen-Sharing-Sitzungen, die gleichen Leistungen wie mit dem „Gold Service Plan“ angeboten.

Der „Bronze Service Plan“ bietet umfassende präventive Wartungsleistungen vor Ort. Ein hochqualifizierter Wyatt-Mitarbeiter kommt zu Ihnen und führt die jährliche präventive Wartung, Kalibrierung und Requalifizierungsprüfung durch.

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In unserem Support Center finden Sie eine Fülle von nützlichen Ressourcen rund um Ihre Wyatt-Lichtstreugeräte, Software und Applikationen:

• Software-Updates und Fehlerbehebungen
• „Technical Notes“ zum Anschluss und zur Arbeit mit Ihren Geräten und Ihrer Software
• Video-Tutorials, Software-Tutorials und Schulungs-Webinare
• Schulungsmaterial mit Anleitungen für neue Anwender
• Referenzmaterialien wie Benutzerhandbücher, Analysezertifikate für von Wyatt gelieferte Standards, CE- und TÜV-Zertifikate

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Wir sind immer da um Sie zu unterstützen

E-Mail: support@wyatt.eu
Telefonnummer: +49 2689 925 0
Geschäftszeiten: Mo - Fr 9:00 – 17:00 Uhr

Nach Vereinbarung können wir eine erweiterte Vor-Ort-Beratung durch einen Applikationswissenschaftler anbieten, der Methoden mit Ihnen optimiert und mit Ihnen Probenmessungen in Ihrem Labor durchführt. So müssen Sie keine Proben zur Analyse an einen anderen Ort schicken und können sich in Echtzeit mit den besten verfügbaren Experten beraten. Die Verfügbarkeit kann auf bestimmte geografische Regionen beschränkt sein.

Wenn Sie möchten, dass unsere Labormitarbeiter Proben für Sie analysieren und Sie beraten, finden Sie auf unserer Website weitere Informationen zum Wyatt Probenanalysen Service.

In unserem Online-Shop können Kunden weltweit nach Teilen, Verbrauchsmaterialien und Zubehör suchen und sich Produktbilder und Teilenummern anzeigen lassen. Der Shop ist nach Wyatt-Produktfamilien kategorisiert, so dass Sie leicht feststellen können, welche Teile mit Ihrem Gerät kompatibel sind. US-amerikanische und kanadische Kunden können sich für ein Konto registrieren und Teile und Zubehör entweder mit einer Bestellung oder einer Kreditkarte bestellen. Für alle anderen Regionen können Sie die Bestellnummer heraussuchen und sich damit direkt an support@wyatt.eu oder info@wyatt.eu wenden.

Wenn Sie Fragen dazu haben, welche SEC-Säule für Ihre Anwendung am besten geeignet ist, werfen Sie einen Blick auf den praktischen SEC Columns Guide der Sie interaktiv zur empfohlenen Säule führt. Neben der Bestellung von Teilen und Zubehör können Sie sich auch über unsere Schulungskurse, IQ/OQ-Validierung und Servicepläne informieren.

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