Größe
Sowohl die Statische Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) als auch die Dynamische Lichtstreuung (DLS) ermöglichen zerstörungsfreie Größenmessungen in Lösung auf der Basis absoluter Analysen, unabhängig von Kalibrierstandards. Diese Techniken sind komplementär und orthogonal indem sie unterschiedliche Eigenschaften des gestreuten Lichts analysieren:
Größe mit MALS
MALS untersucht die Winkelabhängigkeit der zeitlich gemittelten Lichtstreuintensität, um den Streumassenradius Rg (auch bekannt als „Gyrationsradius“) von 10 nm bis zu mehreren hundert Nanometern unabhängig von der Form zu bestimmen wie in der klassischen Lichtstreutheorie beschrieben.
Entspricht die Probe bestimmten Formmodellen wie Kugel, Stäbchen, Random Coil oder beschichtete Kugel, dann kann der Radius oder die halbe Stäbchenlänge mit einem DAWN® 18-Winkel-MALS-Detektor bis zu einer Größe von 1000 nm bestimmt werden. miniDAWN® und microDAWN® 3-Winkel-Detektoren charakterisieren Größen bis zu 50 nm, unabhängig von der Form, und bis zu 150 nm, wenn die Probe formspezifischen Modellen entspricht.
MALS determines size via the angular dependence of the scattered intensity.
Größenverteilungen durch Online-MALS (fraktioniert)
Die Kopplung eines MALS-Detektors mit einer Fraktionierungsmethode wie der Größenausschlusschromatographie (SEC-MALS) oder der Feldflussfraktionierung (FFF-MALS) ist die gängigste Methode zur MALS-Charakterisierung von Größenverteilungen homogener oder heterogener Proben. Die MALS-Analyse liefert den rms-Radius Rg des Analyten bei jedem Elutionsvolumen unabhängig von der Retentionszeit. Da das Detektionsvolumen der MALS-Durchflusszelle viel kleiner ist als ein typischer monomerer Peak, der von SEC oder FFF eluiert, liefert MALS genaue Größenverteilungen, deren Auflösung nur durch das Trennverfahren begrenzt ist.
Anwendungen
SEC-MALS und FFF-MALS bestimmen die Größenverteilungen von:
- Biopolymeren wie Polysacchariden
- PEGylierten Proteinen und großen Proteinkomplexen wie virusähnlichen Partikeln
- Synthetische Polymere
- Liposomen oder Exosomen
- Große Proteinaggregate
Mittlere Größe mit Batch MALS (unfraktioniert)
Eine unfraktionierte oder "Batch"-Messung liefert den Z-gemittelten Radius Rg,z Batch-MALS für Größenmessungen wird durchgeführt, indem die Probe direkt in die DAWN® oder miniDAWN® Durchflusszelle injiziert wird. In der Vergangenheit waren Batch-Messungen mühsam und anfällig für Bedienerfehler; das Calypso® automatisiert Batch-MALS für genaue, zuverlässige und schnelle Ergebnisse.
Anwendungen
Batch-MALS wird häufig zur Analyse verwendet von:
- Sehr großen, unstrukturierten Polymeren, die sich nicht fraktionieren lassen
- Große Proteinansammlungen, die unter der Verdünnung und Scherung, die mit der Fraktionierung einhergehen, dissoziieren
- Polymere, die Gele oder zähflüssige Lösungen bilden, die die Fließwege behindern können
MALS zur Prozessanalytik
Zusätzlich zu den standardmäßigen analytischen Anwendungen von MALS kann es zur Entwicklung, Überwachung und Steuerung von Herstellungsprozessen eingesetzt werden und zwar direkt in der Pilotanlage oder in der Produktionshalle. Das ultraDAWN™ zusammen mit der OBSERVER™-Software bestimmt und berichtet den z-mittleren Effektivradius (Rg) von Protein- oder Polymerlösungen sowie den z-mittleren Radius (Rz) von Nanopartikeln, die das Gerät in Echtzeit passieren; dies wird als RT-MALS bezeichnet.
Online oder Batch MALS
Online oder Batch MALS
DAWN® - Der empfindlichste MALS-Detektor auf dem Markt. Enthält Detektoren auf 18 Winkeln zur Bestimmung von molaren Massen von 200 Da bis 1 GDa und Radien von 10 - 500 nm.
- Standardoption: Umgebungstemperatur
- Beheizte/gekühlte Option: -15 °C bis +150 °C
- Hochtemperatur-Option: Umgebungstemperatur bis +210 °C
Das DAWN bietet spezielle Optionen zur Behandlung fluoreszierender Proben: Fluoreszenzsperrfilter und einen Infrarotlaser (785 nm).
miniDAWN® - Die zweithöchste Empfindlichkeit nach dem DAWN. Enthält Detektoren auf 3 Winkeln zur Bestimmung von molaren Massen von 200 Da bis 10 MDa und Radien von 10 - 50 nm. Nur für Umgebungsbedingungen.
microDAWN® - Der erste MALS-Detektor für die UHPLC, mit einer Interdetektor-Dispersion von nur 1,5 µL. Enthält Detektoren auf 3 Winkeln zur Bestimmung von molaren Massen im Bericht von 200 Da bis 20 MDa und Radien zwischen 10 und 50 nm. Nur für Umgebungsbedingungen.
Calypso® - Präparations- und Probenzufuhrsystem und Software für die Durchführung und Analyse von automatisierten Konzentrations- oder Zusammensetzungsgradienten in einem MALS-Detektor. Automatisiert zuverlässige und wiederholbare Zimm-Plots sowie die Messung der zeit- oder zusammensetzungsabhängigen Größe in einem DAWN oder miniDAWN.
Software
ASTRA® - Unsere umfassende Softwarelösung für MALS- und DLS-Analysen im Chromatographie-, AF4- oder Batch-Modus. ASTRA ist in einer „21 CFR Part 11“-konformen Version erhältlich und bietet zusätzliche Optionen wie die Partikelanalyse.
CALYPSO™ - Die CALYPSO-Software analysiert keine DLS-Daten, kann aber so eingestellt werden, dass sie Verdünnungen oder Zusammensetzungsgradienten steuert, die an einen MALS- oder Mobius-Detektor geliefert werden, und die DLS-Datenerfassung durch die Wyatt-Softwarepakete ASTRA oder DYNAMICS auslöst.
Größe mittels DLS
DLS nutzt die zeitabhängigen Fluktuationen der Lichtstreuintensität, die durch Brownsche Molekularbewegung entstehen, um die Diffusionskonstante zu bestimmen. Der hydrodynamische Radius Rh wird dann direkt, wie in der DLS-Theorie, berechnet. Im Gegensatz zu MALS erfordert DLS in der Regel keine genaue Kenntnis der Probenkonzentration, benötigt aber genaue Werte für die Viskosität des Lösungsmittels und die Temperatur.
DLS bestimmt die Größe über die Fluktuationsrate des Lichtstreusignals.
Größenverteilungen durch Online-DLS (fraktioniert)
Der hydrodynamische Radius kann mit DLS online in SEC MALS oder FFF MALS gemessen werden, indem ein WyattQELS™-Modul in einen DAWN-, miniDAWN- oder microDAWN-MALS-Detektor integriert wird, oder indem das im MALS-Detektor gesammelte Licht über eine optische Faser zu einem Batch-DLS-Detektor wie dem DynaPro® NanoStar® oder Mobius®. übertragen wird. Je nach verwendeten Winkel für die DLS Messungen, Laserwellenlänge und Durchflussrate kann Online-DLS so hydrodynamische Radien Rh von 1 nm bis ~250 nm analysieren.
Anwendungen
- Quantenpunkte und metallische Nanopartikel wie zum Beispiel Gold Paritkel unter einer bestimmten Größe, ihres anomalen Brechungsindexes nicht für die MALS-Analyse geeignet sind
- Konformation von Proteinen und Proteinaggregaten
- In Verbindung mit der MALS-Größenbestimmung (Rg), Konformationen von Biopolymeren und anderen heterogenen Makromolekülen, z. B. zur Unterscheidung zwischen gefüllten und ungefüllten Liposomen als Träger für Arzneimittel
Größenbestimmung durch Batch-DLS (unfraktioniert)
DLS kann im Batch-Modus also direkt in der Küvette Partikel mit einem Radius von 0,2 nm bis zu 2500 nm messen. Ein weiteres wertvolles Merkmal der DLS im Batch-Modus ist die Möglichkeit, mit Hilfe der Regularisierungsanalyse eine grobe Größenverteilung ohne jegliche Fraktionierung zu extrahieren. Während die aus der Batch-DLS berechneten Verteilungen nur Populationen klar trennen können, die sich im Radius um das 3-5-fache unterscheiden, können Aggregate und andere Formen der Heterogenität über die Peak-Breite erfasst werden, die ein Maß für die Polydispersität ist.
- Die Kumulantenanalyse schätzt die Polydispersität einer "monomodalen" Verteilung der Partikelgrößen
- Durch die NNLS-Regularisierungsanalyse unterscheidet die DLS zwischen Partikelpopulationen, die sich in der Größe um mindestens das 3-5fache unterscheiden
Trotz der geringen Größenauflösung ist DLS recht empfindlich gegenüber Verschiebungen in der Durchschnittsgröße. Die Fähigkeit, Größenverschiebungen von nur 1-2 % zu erkennen, wird bei der Analyse der Proteinentfaltung am thermischen Schmelzübergang, der Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen anhand der Konzentrations- oder Zusammensetzungsabhängigkeit der Größe und sogar der Bindung von Lipiden oder Oligonukleotiden an Nanopartikel verwendet.
Der DynaPro NanoStar ermöglicht Batch-DLS in hochwertigen Quarz-Mikroküvetten oder Einweg-Kunststoffküvetten, während der DAWN und miniDAWN Batch-DLS in der Durchflusszelle ("Microbatch") oder in einer 10-µL-Quarz-Mikroküvette unter Verwendung des microCuvette Adapter Kits ermöglichen.
Anwendungen
- Schnelle Schätzungen der durchschnittlichen Größe und Polydispersität von organischen und anorganischen Nanopartikeln
- Schnelle Qualitätskontrolle von Proteinexpression und -aufreinigung, Prüfung auf große Aggregate
- Einfache, semi-quantitative Bewertung von Oligomerisierungs- oder Aggregationszustände
- Aggregationsverhalten mit Temperaturänderung und Protein-Protein-Interaktionsstudien
Größenbestimmung mit hohem Probendurchsatz durch Batch-DLS
DLS reagiert zwar weniger empfindlich auf niedrige Probenkonzentrationen als MALS, ist aber auch weniger anfällig für Störungen durch Streulicht und kann daher unter weniger strengen optischen Bedingungen durchgeführt werden. Der DynaPro® Plate Reader macht sich diese besondere Fähigkeit zunutze, um automatisierte DLS-Messungen direkt vor Ort in Standard-Mikrotiterplatten durchzuführen und dabei Hunderte oder sogar Tausende von Proben und Probenbedingungen pro Tag zu messen.
Anwendungen
- Hochdurchsatz-Screening optimaler Formulierungsbedingungen für Proteine und biotherapeutische Komplexe wie virusähnliche Partikel, basierend auf Kriterien wie Aggregation und thermisch induzierte Anfangstemperatur der Aggregation
- Bestimmung der Schmelztemperatur von Proteinen in Abhängigkeit von den Formulierungsbedingungen (Hilfsstoffe, pH-Wert, usw.)
- Charakterisierung unspezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen über den Diffusionswechselwirkungsparameter kD, der anhand der Konzentrationsabhängigkeit des Diffusionskoeffizienten ermittelt wird
Online DLS
Detektoren für dynamische Lichtstreuung
DynaPro® NanoStar® - Der küvettenbasierte DLS-Detektor NanoStar erfüllt eine Doppelfunktion als Online-DLS-Detektor, indem seine optische Sammelfaser optional an einen Wyatt-MALS-Detektor eingeschlossen werden kann.
WyattQELS™ - Ein DLS-Modul, das in einen DAWN-, miniDAWN- oder microDAWN-MALS-Detektor integriert werden kann, um gleichzeitige DLS-Messungen im gleichen Streuvolumen wie die primäre MALS-Messung durchzuführen.
Software
DYNAMICS® - Software für DLS-Batch-Messungen in den DynaPro- und Mobius®-Instrumenten sowie für Molmasse und A2 im NanoStar und DynaPro Plate Reader und elektrophoretische Mobilität im Mobius. Berechnet Größe und Größenverteilungen und leitet Parameter wie die Schmelztemperatur Tm, die Temperatur des Aggregationsbeginns Tagg und den Diffusionswechselwirkungsparameter kD ab.
CALYPSO™ - Die CALYPSO-Software analysiert keine DLS-Daten, kann aber so eingestellt werden, dass sie Verdünnungen oder Zusammensetzungsgradienten steuert, die an einen MALS- oder Mobius-Detektor geliefert werden, und die DLS-Datenerfassung durch die Wyatt-Softwarepakete ASTRA oder DYNAMICS auslöst.
Batch DLS
Batch DLS Instrumente
DynaPro® Plate Reader - Das einzige im Handel erhältliche Gerät, das DLS direkt in situ in standardmäßigen 96er, 384er oder 1536er Mikrotiterplatten misst. Der DynaPro Plate Reader lässt sich in Roboter-Flüssigkeitshandler und plattenbasierte Assay-Protokolle mit mehreren Techniken integrieren. Er verfügt über eine Temperatursteuerung zwischen 4 °C und 85 °C. Eine integrierte Kamera zeigt jedes Well zur Fehlersuche und Diagnose an.
DynaPro® NanoStar® - Mit einem Probenvolumen von nur 2 µL und einer Temperaturregelung von -10 °C bis +120 °C geht der NanoStar weit über herkömmliche DLS-Instrumente auf Küvettenbasis hinaus. Er bietet einen optimierten statischen Lichtstreudetektor parallel zum DLS-Detektionssystem, um die wahre molare Masse zu bestimmen. Das NanoStar erfüllt eine Doppelfunktion als Online-DLS-Detektor, indem seine optische Sammelfaser optional an einen Wyatt MALS-Detektor angeschlossen werden kann.
Mobius® - Kombiniert Größenbestimmung durch dynamische Lichtstreuung mit gleichzeitiger Messung der elektrophoretischen Mobilität.
Calypso® - Präparations- und Probenzufuhrsystem und Software für die Durchführung und Analyse automatischer Konzentrations- oder Zusammensetzungsgradienten in einem MALS-Detektor. Automatisiert zuverlässige und wiederholbare zeit- oder zusammensetzungsabhängige Größenmessungen durch DLS in einem DAWN oder miniDAWN, ausgestattet mit WyattQELS oder Verbindung mit einem NanoStar.
microCuvette - Ermöglicht die gleichzeitige Durchführung von statischen und dynamischen Lichtstreumessungen in einem DAWN mit einer Quarzküvette, die nur 10 µL benötigt.
Microbatch Kit - Wird verwendet, um Proben in die Durchflusszelle eines MALS-Detektors zu injizieren.
NanoFilter Kit - Erleichtert das Filtern, Rückgewinnen und erneutes Filtern wertvoller Proben. Dies ist besonders nützlich, wenn Ihr Gesamtprobenvolumen unter 300 µL liegt.
Eine Reihe von Bildern, die von der Onboard-Kamera aufgenommen wurden und saubere Wells sowie Wells mit Blasen, Kristallen und Ablagerungen zeigen.
Größe durch Viskosimetrie
Für Polymere ist die Größenbestimmung durch Viskosimetrie oft besser geeignet als DLS. Die Größe wird aus der Einstein-Simha-Gleichung bestimmt, die die intrinsische Viskosität mit der Größe und der molaren Masse in Beziehung setzt. Die Viskosimetrie ist für kleine Makromoleküle empfindlicher als DLS und ist daher die bevorzugte Technik für Polymere und Peptide unter 10 nm im Radius.
Größenverteilung durch intrinsische Viskosität + MALS
Wenn Polymere zu klein sind, um die Größenverteilungen direkt durch Online-MALS zu bestimmen, bietet die Ergänzung des SEC-Gerätesatzes durch einen ViscoStar® oder
microViscoStar® eine alternative Lösung. Das hydrodynamische Volumen steht über die Einstein-Simha-Beziehung
Vh=M[η]/(2.5NA) in direktem Zusammenhang mit dem Produkt aus Molmasse und intrinsischer Viskosität, und der hydrodynamische Radius kann aus dem hydrodynamischen Volumen berechnet werden.
Da sowohl die intrinsiche Viskosität als auch die molare Masse ohne Annahmen bestimmt wird, liefert die SEC-MALS-IV-Analyse eine objektive Schätzung der Molekülgröße, die unabhängig von Säuleninteraktionen berechnet wird.
Viskometrie und dRI
Viskosimeter
ViscoStar® - Ein hochempfindliches Online-Differenzialviskosimeter, das in Verbindung mit SEC-MALS zur Bestimmung der Größe und Konformation aller Arten von Biopolymeren, synthetischen Polymeren und sogar Proteinen und Peptiden verwendet wird.
Der ViscoStar umfasst mehrere neuartige Technologien, um die höchste Empfindlichkeit, Stabilität und Lösungsmittelkompatibilität aller verfügbaren Viskosimeter für die GPC zu gewährleisten. Seine Benutzer- und Wartungsfreundlichkeit machen ihn zur perfekten Ergänzung für die Lichtstreuungs- und Brechungsindexdetektoren DAWN® und Optilab® von Wyatt. Es hat eine Temperatursteuerung von 4 °C bis 70 °C.
microViscoStar™ - Ähnlich wie der ViscoStar, jedoch speziell für die Verwendung mit UHPLC/APC konzipiert.
Brechungsindex-Detektoren
Optilab® - Ein einzigartiges Online-Differenzialrefraktometer zur Messung der Konzentration beliebiger Makromoleküle, unabhängig von den Chromophoren. Die Temperaturregelung liegt im Bereich von 4 °C bis 65 °C. Die Hochkonzentrationsoption eignet sich für Proteinkonzentrationen bis zu 180 mg/mL.
microOptilab™ - Der erste RI-Detektor, der speziell für die Verwendung mit allen UHPLC-Systemen entwickelt wurde.
Größenbestimmung mittels FFF
Feldflussfraktionierungssysteme
Die Feldflussfraktionierung (FFF) ermöglicht vielseitige Trennungen von Makromolekülen und Nanopartikeln mit einem Durchmesser von 1 bis 1000 nm und darüber hinaus. FFF-MALS-DLS ist das ideale Mittel, um Verteilungen von molaren Massen und Größe, die Konzentration von Nanopartikeln und eine erweiterte Charakterisierung von Konformation und Konjugatgehalt zu bestimmen.
Eclipse™ - Ein FFF-Instrument mit hervorragender Leistung, Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit. Unterstützt das Dilution Control Module™ für verbesserte Empfindlichkeit und die SEC-Umschaltoption für die gemeinsame Nutzung des Systems zwischen FFF- und SEC-Trennmodi.
Mobility™ EAF4 System - Ein Zusatzgerät zu einer Eclipse, das FFF mit elektrischer/asymmetrischer Strömung zur Bestimmung von Ladungs- und Zetapotenzialverteilungen durchführt.
Eclipse Kanäle - Die Eclipse bietet eine große Auswahl an Trennkanälen und Membranen für eine Vielzahl von analytischen und sogar semipräparativen Aufgaben.
Software
VISION™ - Steuert das Eclipse Field-Flow Fractionation (FFF)-System. In Verbindung mit ASTRA für die Datenerfassung und -analyse bietet VISION dem Anwender eine schlüsselfertige Lösung für die makromolekulare Charakterisierung.
Zusätzliche Ressourcen
Application notes
Organic-phase encapsulation in protein-based nanocapsules studied by DLS
pH effects on stability and homogeneity of a protein complex analyzed by DLS
Nanoparticle Dispersions in Cell Culture Media Characterized by High-Throughput DLS
High-Throughput Tools for Optimizing Drug Nanosuspensions
Probing the aggregation rate of Tau protein with automated DLS and SLS
Characterization of AAV-based viral vectors by DynaPro DLS/SLS instruments
Overcoming the Challenges of Nanoparticle Characterization with a Light Scattering Toolkit
Ausgewählte Literatur
Ahmad, A.; Uversky, V. N.; Hong, D.; Fink, A. L. Early events in the fibrillation of monomeric insulin. J. Biol. Chem. 2005, 280, 42669-42675.
Aichmayer, B.; Widermann-Bidlack, F. B.; Gilow, C.; Simmer, J. P.; Yamakoshi, Y.; Emmerling, F.; Margolis, H. C.; Fratzl, P. Amelogenin nanoparticles in suspension: deviations from spherical shape and pH-dependent aggregation. Biomacromolecules 2010, 11, 369-376.
Striegel, A. M. Architecture on the mechanochemical degradation of macromolecules. J. Biochem. Bioph. Meth. 2003, 56, 117-139.
Tarazona, M. P; Saiz, E. Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules. J. Biochem. Bioph. Meth. 2003, 56, 95-116.
Wyatt, P. Submicrometer particle sizing by multiangle light scattering following fractionation. J. Colloid Interf. Sci. 1998, 197, 9-20.